دراسة فعالية جسيمات الفضة النانوية المحملة على السليلوز على انواع مختلفه من البكتيريا المرضية " Studying the Effectiveness of Silver Nanoparticles Loaded on Cellulose on Different Types of Pathogenic Bacteria"

المستخلص
هدفت الدراسة الحالية الى اختبار فعالية جسيمات الفضة النانوية المحملة على السيليلوز البكتيري والنانوسيليلوز البكتيري تجاه الجراثيم المعزولة من الحروق والجروح ، حيث جمعت 150 عينة من مرضى الجروح والحروق باعمار مختلفة والتي شملت، 75 عينة من اخماج الحروق، 75 عينة اخماج الجروح، من مستشفيات مدينة الطب في بغداد (مستشفى بغداد التعليمي , مدينة الامامين الكاظمين الطبية , مستشفى الحروق التخصصي , مستشفى اليرموك , المختبرات التعليمية , مستشفى الطفل المركزي) للمدة بين 20 تشرين الثاني 2022 ولغاية 29 كانون الأول 2022.
اجريت الفحوصات التشخيصية المظهرية، المجهرية، الكيموحيوية والفحص التأكيدي بنظام فايتك-2 المدمج للعزلات البكتيرية. تم الحصول على 70 عزلة بكتيرية والتي شملت 17 عزلة من بكتريا الإشريكية القولونية بنسبة مئوية بلغت 24.28%، تليها 16 عزلة من الكليبسيلا الرئوية وبنسبة مئوية 22.85%، ثم 15 عزلة من بكتريا الزائفة الزنجارية وبنسبة 20.83% كذلك تم عزل 12 عزلة من المكورات العنقودية الذهبية بنسبة 17.14% وأخيراً 10 عزلات من بكتريا الليمونية فروندي وبنسبة 14.28%.
أظهر اختبار الحساسية للمضادات الحيوية بطريقة انتشار القرص، أن معظم العزلات البكتيرية بجميع أنواعها كانت مقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة. قاومت عزلات الليمونية فروندي المضادات الحيوية مثل الميروبينيم والكوليستين والجنتاميسين والليفوفلوكساسين والإيميبينيم والسيبروفلوكساسين. وهي حساسة للمضادات الحيوية أميكاسين والسيفتازيديم. أما عزلات الإشريكية القولونية فقد كانت مقاومة للمضاد الحيوي الميروبينيم، وحساسة للمضاد الحيوي أميكاسين، وهي متوسطة المقاومة لبقية أنواع المضادات الحيوية المستخدمة. وكانت عزلات الكليبسيلا الرئوية مقاومة للميروبينيم ومتوسطة المقاومة للمضادات الحيوية الأخرى. أظهرت عزلات الزائفة الزنجارية مقاومة للمضادات الحيوية الميروبينيم والكوليستين والليفوفلوكساسين. ولكنها أظهرت مقاومة معتدلة للمضادات الحيوية الأخرى التي تم اختبارها. وأخيرا، قاومت عزلات المكورات العنقودية الذهبية المضادات الحيوية الميروبينيم والجنتاميسين والإيميبينيم والأميكاسين. وهي مقاومة بشكل معتدل للمضادات الحيوية الأخرى المستخدمة. أظهر التحليل الإحصائي وجود اختلافات كبيرة عند p<0.05 بين كل من البكتيريا والمضادات الحيوية.
أظهرت نتائج اختبار الحساسية المضادة للميكروبات للبكتيريا سالبة الجرام بطريقة نظام فايتك 2 المضغوط، أن عزلات الليمونية فروندي كانت مقاومة للمضادات الحيوية امبسيلين، كانت مقاومة للمضادات الحيوية أمبيسيلين، بيبيراسيلين/تازوباكتام، سيفترياكسون، سيفوكسيتين، سيفيبيم، إيميبينيم، سيفازولين وسيفتازيديم. وهو حساس للمضادات الحيوية أميكاسين، ليفوفلوكساسين، جنتاميسين، سيبروفلوكساسين، تيكارسيلين/حمض كلافولانيك، نيتروفورانتوين وتريميثوبريم/سلفاميثوكسازول. أما بالنسبة لعزلات الإشريكية القولونية فقد كانت مقاومة للمضاد الحيوي الأمبيسلين ومتوسطة المقاومة لبقية المضادات الحيوية المستخدمة. كانت عزلات الكلبسيلة الرئوية مقاومة للمضاد الحيوي الأمبيسيلين وحساسة للمضاد الحيوي تيكارسيلين/حمض الكلافولانيك. وهي ذو مقاومة متوسطة لبقية المضادات الحيوية المستخدمة. وفي الوقت نفسه، أظهرت عزلات الزائفة الزنجارية مقاومة للمضادات الحيوية الأمبيسيلين، بيبيراسيلين/تازوباكتام، سيفتازيديم، وتريميثوبريم/سلفاميثوكسازول. المقاومة لبقية المضادات الحيوية المستخدمة متوسطة وأظهر التحليل الإحصائي فروق ذات دلالة إحصائية عالية عند p<0.001 بين كل من البكتيريا والمضادات الحيوية. أما الموجبة الجرام فكانت عزلات المكورات العنقودية الذهبية مقاومة للبيبيراسيللين، الأموكسيسيلين، الليفوفلوكساسين، التتراسيكلين، والنيتروفورانتوين. وهو حساس للمضادات الحيوية توبراميسين، لينزوليد، فانكومايسين، تيكارسيلين/حمض كلافولانيك، ريفامبيسين، وجنتاميسين. وهو مقاوم بشكل معتدل لحمض الفوسيديك والكليندامايسين ويظهر التحليل الإحصائي وجود اختلافات كبيرة عند p<0.05 بين جميع المضادات الحيوية. 
تم الحصول على قرص السليلوز البكتيري من تنمية القرص البادئ لأم الخل على وسط الشاي المحلى بدرجة حرارة 25 °م لمدة 7-10 ايام. تم بعد ذلك تنقيته وفحص خواصه. أظهرت قمم أطياف الاشعة فوق البنفسجية-المرئية، أطياف الأشعة تحت الحمراء و قمم حيود الأشعة السينية المقابلة لـ (101) و (002) للمستويات البلورية أن البكتريا الموجودة في ام الخل أنتجت شكلاً بوليمريًا من السليلوز البكتيري. تم استخدام طريقة (Babicka, et. al., 2021) لتحضير السليلوز النانوي من السليلوزالبكتيري باستخدام السوائل الأيونية مع المعالجة الأنزيمية. أثبتت نتائج الفحص بجهاز مطياف الاشعة فوق البنفسجية-المرئية، مطياف الاشعة تحت الحمراء، جهاز حيود الاشعة السينبة ان المادة هي النانوسليلوز البكتيري. تم تحضير السليلوز البكتيري و النانوسليلوز البكتيري المغمور بالفضة النانوية بطريقة الاختزال الحراري (Salama et. al., 2021). بين نتائج فحص المادة الاخيرة بجهاز مطياف الاشعة تحت الحمراء، جهاز حيود الاشعة السينية، المجهر الألكتروني الماسح، جهاز الاشعة المشتتة للطاقة، مجهر القوة الذرية وقياس جهد زيتا مطياف الاشعة تحت الحمراء، جهاز حيود الاشعة السينبة والمجهر الالكتروني الماسح ان المادة هي النانوسليلوز البكتيري المغمور بالفضة النانوية. 
تم أستخدام طريقة لوحة المعايرة الدقيقة المكونة من 96 حفرة والمعتمدة على الريسازورين (ريما) لتحديد التركيز المثبط الادنى لجسيمات الفضة النانوية المحملة على السيليلوز البكتيري والنانوسيليلوز البكتيري على العزلات قيد الدراسة. أظهرت النتائج أن التركيز المثبط الادنى (MIC) لجسيمات الفضة النانوية المحملة على السيليلوز البكتيري تجاه الليمونية فروندي كان بين (1000-15.62 ميكروغرام/مل)، وفي الإشريكية القولونية كان بين (500-15.62 ميكروغرام/مل)، وفي الكلبسيلا الرئوية بين (500-15.62 ميكروغرام). /مل)، في الزائفة الزنجارية بين (250-15.62 ميكروغرام/مل) وفي المكورات العنقودية الذهبية بين (500-15.62 ميكروغرام/مل). بينما كان الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) لجسيمات الفضة النانوية المحملة على النانوسيليلوز البكتيري تجاه الليمونية فروندي كان بين (1000-15.62 ميكروغرام/مل)، في الإشريكية القولونية كان بين (1000-15.62 ميكروغرام/مل)، في الكلبسيلا الرئوية بين (1000-15.62). ميكروغرام/مل)، بالنسبة للزائفة الزنجارية كان بين (1000-15.62 ميكروغرام/مل) وفي المكورات العنقودية الذهبية بين (1000-31.25 ميكروغرام/مل).
بينت هذه الدراسة أن ستين عزلة من العزلات البكتيرية السبعين أنتجت الأغشية الحيوية بنسبة 85.71%، وأن 10 عزلات (14.28%) لم تكن منتجة للأغشية الحيوية. أظهر تأثير جسيمات الفضة النانوية المحملة على السيليلوز البكتيري والنانوسيليلوز البكتيري بالتركيز تحت المثبط الادنى (½ MIC، ¼ MIC و ⅛ MIC) تأثيرها على تكوين الأغشية الحيوية لخمسة وعشرون عزلة منتخبة، حيث منعت هذه التراكيز تكوين الأغشية الحيوية ولكن تاثيرها عكسيا مع انخفاض تركيز الفضة النانوية المحملة على السيلوز البكتيري والنانوسليلوز البكتيري.
تم تحديد النسب المئوية للنشاط المضاد للأكسدة لكل من السيليلوز البكتيري والنانوسيليلوز البكتيري المحمل بالفضة النانوية بالمقارنة مع حمض الاسكوربيك حيث بينت النتائج انه كلما ارتفع التركيز زادت النسبة المئوية للنشاط المضاد للأكسدة.
وأخيرا اجري التشخيص الجزيئي للتحري عن الجينين hla و sec في 5 عزلات من بكتريا المكورات العنقودية الذهبية والجينين oprI و toxA في بكتريا الزائفة الزنجارية باستعمال تفاعل البلمرة المتسلسل ، واظهرت النتائج ان جميع العزلات كانت تمتلك الجينين hla و oprIفيما كانت 80% من العزلات تمتلك الجين toxA في حين ان الجين sec لم يظهر في اي عزلة. كذلك اجري تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل وحددت قيم التعبير الجيني للجينين hla و oprI بعد معاملة البكتريا بالسليليوز البكتيري والنانوسليلوز البكتيري المحمل بالفضة النانوية ، فاظهر الجين الاول انخفاض معنوي في التعبير الجيني بينما اظهر الجين الثاني ارتفاع معنوي في التعبير الجيني.

Summary 
The current study aimed to test the effectiveness of silver nanoparticles loaded on bacterial cellulose and bacterial nanocellulose against bacteria isolated from burns and wounds. It collected 150 samples from wound and burn patients of different ages, which included 75 samples of burn infections and 75 samples of wound infections, from Medical City hospitals. In Baghdad (Baghdad Teaching Hospital, Al-Imam Al-Kazemin Medical City, Specialized Burns Hospital, Yarmouk Hospital, Educational Laboratories, Central Children’s Hospital) for the period between November 20, 2022, until December 29, 2022.
Phenotypic, microscopic, biochemical and confirmatory examinations were performed with the FITEK-2 compact system for the bacterial isolates. 70 bacterial isolates were obtained, which included 17 isolates of Escherichia coli with a percentage of 24.28%, followed by 16 isolates of Klebsiella pneumoniae with a percentage of 22.85%, then 15 isolates of Pseudomonas aeruginosa with a percentage of 20.83%. Also, 12 isolates of Staphylococcus aureus were isolated with a rate of 17.14%, and finally 10 isolates of the bacterium Citrobacter freundii, with a rate of 14.28%.
Antibiotic susceptibility testing (AST) by disk diffusion method showed that most of the bacterial isolates of all types were resistant to the antibiotics used. Citrobacter freundii isolates were resistant to antibiotics such as meropenem, colistin, gentamicin, levofloxacin, imipenem, and ciprofloxacin. It is sensitive to the amikacin and ceftazidime. As for the Escherichia coli isolates, they were resistant to the antibiotic meropenem, sensitive to the amikacin, and moderately resistant to the rest types of antibiotics used. Klebsiella pneumoniae isolates were resistant to meropenem and moderately resistant to other antibiotics. Pseudomonas aeruginosa isolates showed resistance to the meropenem, colistin, and levofloxacin. But it showed moderate resistance to other antibiotics tested. Finally, S. aureus isolates were resistant to meropenem, gentamicin, imipenem, and amikacin. It is moderately resistant to other antibiotics used. Statistical analysis showed significant differences at p<0.05 between both bacteria and antibiotics.
The results of the AST for Gram-negative bacteria using the FITEK-2 compact system method showed that the Citrobacter freundii isolates were resistant to the ampicillin, piperacillin/tazobactam, ceftriaxone, cefoxitin, cefepime, imipenem, cefazolin and ceftazidime. It is sensitive to the antibiotics amikacin, levofloxacin, gentamicin, ciprofloxacin, ticarcillin/clavulanic acid, nitrofurantoin and trimethoprim/sulfamethoxazole. As for Escherichia coli isolates, they were resistant to the antibiotic ampicillin and moderately resistant to the rest of the antibiotics used. Klebsiella pneumoniae isolates were resistant to the antibiotic ampicillin and sensitive to the ticarcillin/clavulanic acid. It is moderately resistant to the rest antibiotics used. Meanwhile, Pseudomonas aeruginosa isolates showed resistance to the ampicillin, piperacillin/tazobactam, ceftazidime, and trimethoprim/sulfamethoxazole. Resistance to the rest antibiotics used was moderate. As for Gram-positive Staphylococcus aureus isolates, they were resistant to piperacillin, amoxicillin, levofloxacin, tetracycline, and nitrofurantoin. 
It is sensitive to the antibiotics tobramycin, linezolid, vancomycin, ticarcillin/clavulanic acid, rifampicin, and gentamicin. It is moderately resistant to Fusidic acid and clindamycin. Statistical analysis showed significant differences at p<0.05 between all antibiotics.
Bacterial cellulose disc was obtained by growing the starter disc of vinegar mother on sweetened tea medium at a temperature of 25°C for 7-10 days. It was then purified and its properties were examined. The peaks of the UV-visible spectra, the infrared spectra and the X-ray diffraction peaks corresponding to (101) and (002) crystal planes showed that the bacteria present in the vinegar mother produced a polymeric form of bacterial cellulose.
The method (Babicka, et. al., 2021) was used to prepare nanocellulose from bacterial cellulose using ionic liquids with enzymatic treatment. The results of the examination with an ultraviolet-visible spectrometer, an infrared spectrometer, and an X-ray diffraction device proved that the material is bacterial nanocellulose.
Bacterial cellulose and bacterial nanocellulose loaded with Silver Nanoparticles were prepared by the thermal reduction method (Salama et. al., 2021). Among the results of examining the last substance with an FTIR Spectrophotometer, XRD, SEM, EXD, AFM and Zeta potential, the material is bacterial nanocellulose immersed in silver nanoparticles.
The resazurin-based 96-hole microtiter plate method (RIMA) was used to determine the minimum inhibitory concentration of silver nanoparticles loaded on bacterial cellulose and bacterial nanocellulose on the isolates under study. The results showed that the minimum inhibitory concentration (MIC) of silver nanoparticles loaded on bacterial cellulose against Citrobacter freundii was between (1000-15.62 µg/ml), in Escherichia coli it was between (500-15.62 µg/ml), and in Klebsiella pneumoniae it was between (500-15.62 µg/ml), in Pseudomonas aeruginosa between (500-15.62 μg/ml) and in Staphylococcus aureus between (500-15.62 μg/ml). While the minimum inhibitory concentration (MIC) of silver nanoparticles loaded on bacterial nanocellulose towards Citrobacter freundii was between (1000-15.62 μg/ml), in Escherichia coli it was between (1000-15.62 μg/ml), and in Klebsiella pneumoniae it was between (1000-15.62 μg/ml), for Pseudomonas aeruginosa it was between (1000-15.62 µg/ml) and for Staphylococcus aureus it was between (1000-15.62 µg/ml).
This study showed that sixty of the seventy bacterial isolates produced biofilms at a rate of 85.71%, and that 10 isolates (14.28%) were not biofilm producers. The effect of silver nanoparticles loaded on bacterial cellulose and bacterial nanocellulose at the sub minimum inhibitory concentration (½ MIC, ¼ MIC and ⅛ MIC) showed their effect on the formation of biofilms for twenty-five selected isolates. These concentrations prevented the formation of biofilms, but their effect was opposite with a lower concentration of silver nanoparticles loaded on bacterial cellulose and bacterial nanocellulose. 
The percentages of antioxidant activity for both bacterial cellulose and bacterial nanocellulose loaded with silver nanoparticles were determined in comparison with ascorbic acid. The results showed that increasing the concentration of silver nanoparticles loaded on bacterial cellulose and bacterial nanocellulose leads to an increase in the percentage of antioxidant activity.
Finally, molecular diagnosis was conducted to investigate the hla and sec genes in 5 isolates of Staphylococcus aureus, and the oprI and toxA genes in Pseudomonas aeruginosa using polymerase chain reaction. The results showed that all isolates possessed the hla and oprI genes, while 80% of the isolates possessed the toxA gene. While the sec gene did not appear in any isolate. 
Quantitative polymerase chain reaction was also conducted and gene expression values ​​for the genes hla and oprI were determined after treating the bacteria with bacterial cellulose and bacterial nanocellulose loaded with silver nanoparticles.
The first gene showed a significant decrease in gene expression while the second gene showed a significant increase in gene expression.